Венерология

Что такое ПЦР анализ

Одним из современных вариантов исследований на лабораторном этапе является метод полимеразной цепной реакции (аббревиатура стандартная – ПЦР, PCR от «polymerase chain reaction»).

Что же это такое – ПЦР анализ?

Метод ПЦР диагностики представляет собой создание большого числа копий (иначе амплификаций) изучаемого участка ДНК путем ферментативного воспроизведения.

Нарастание концентрации нуклеиновой кислоты дает возможность визуально сравнить ее с образцом и определить вид возбудителя инфекции.

Собственно принцип был предложен в 1983 году американским биохимиком Кэри Мюллисом (через 10 лет за эту работу исследователь был награжден Нобелевской премией).

что такое ПЦР анализ

 

Для чего необходимо исследование методом ПЦР?

В медицинской области находит широкое использование ПЦР диагностика инфекций, в том числе и передаваемых преимущественно половым путем:

  • герпетической, вызванной вирусами герпеса генитального (2 тип); оспы ветряной (3 тип); герпеса простого (тип1); Эпштейна-Барр (4 тип); цитомегаловируса (5 тип); 6-го типа – причины инфекционной розеолы, пневмонии интерстициальной; 7-го типа – причины экзантемы внезапной, предполагаемой причины синдрома хронической усталости; 8-го типа, ассоциируемого с саркомой Капоши;
  • папилломавирусной – с целью выявления типа вируса и его групповой принадлежности (высокой онкогенной активности – 16го, 18го и других типов, связанных с развитием рака шейки матки, низкой – преимущественно 6го и 11го типов, вызывающих появление аногенитальных бородавок);
  • хламидийной (особенно рекомендуется беременным, проводится при первичном обращении к доктору и в 3-ем триместре);
  • мико- и уреаплазменной;
  • гонококковой (диагностика данным методом распространена в РФ);
  • трихомонадной;
  • кандидозной при подозрении на воздействие нетипичных представителей грибов дрожжеподобных рода Candida (Candida nonalbicans, в отличие более привычных Candida albicans, отличаются повышенной стойкостью к обычным противогрибковым препаратам);
  • туберкулезной;
  • ВИЧ;
  • гепатитов и пр.

Помимо этого, метод ПЦР диагностики является основным исследовательским вариантом при подозрении на вагиноз бактериальный.

Позволяя обнаружить такие маркеры данного состояния, как гарднереллы, мобилинкус и пр., определить состав микрофлоры влагалища с целью подбора адекватных терапевтических схем.

ПЦР диагностика используется в обнаружении опухолевых образований и генетических отклонений.

ПЦР исследования

Модификацией метода является его комбинация с предшествующим разрезанием молекулы ДНК особыми ферментами – эндонуклеазами.

Данное исследование называется ПЦР-рестрикционным анализом продуктов амплификации (PCR RFLP) и распространено в иммунологии.

ПЦР находит применение не только в диагностике инфекционных болезней.

Но также и для выявления наследственных патологий, установления отцовства, в исследовательских целях для введения мутаций, клонирования генов или выделения новых, сращивания ДНК фрагментов.

Все это обуславливает интерес к методу в таких областях, как:

  • судебная медицина;
  • криминалистика;
  • ветеринария;
  • сельское хозяйство;
  • палеонтология;
  • антропология и пр.

 

На чем основана диагностика методом ПЦР?

В живых организмах за хранение и передачу генетических данных отвечает макромолекула дезоксирибонуклеиновой кислоты – сокращенно ДНК.

Такая информация «зафиксирована» в виде особого кода, который представляет собой строгую последовательность нуклеотидов ‑ производных гуанина, аденина, цитозина и тимина.

Сама макромолекула имеет форму спирали из двух цепочек.

Нуклеотиды соседних участков разных цепочек оказываются скреплены водородными связями, при этом «хвост» одной цепи располагается напротив «головы» другой.

Подобное взаимодействие осуществляется в строго определенном порядке: тимин одной цепочки связывается с аденином другой, а цитозин ‑ с гуанином (т.н. правило комплементарности).

Используя принцип взаимодействия в лаборатории с помощью фермента полимеразы можно синтезировать вторую цепочку при наличии одной.

Как использует такое явление ПЦР диагностика, что происходит в процессе анализа, как это помогает определить возбудителя инфекции?

У каждого организма ДНК имеет свое особое строение.

уникальная ДНК микроорганизма

У некоторых организмов, в т.ч. у вируса иммунодефицита человека информация «записана» в РНК, но обсуждаемый метод позволяет идентифицировать и эти молекулы).

Практически для всех известных патогенных микроорганизмов установлен генетический код и имеется эталонный образец ДНК.

В процессе исследования происходит многократное воспроизведение содержащегося в образце фрагмента ДНК, в результате количество последнего возрастает и становится достаточным для сравнения с эталоном.

Поняв, что это такое – ПЦР анализ, следует разобраться и как делают его.

Для проведения исследования требуются:

  • собственно образец, содержащий «подозрительную» молекулу ДНК (или хотя бы ее фрагмент), которая будет матрицей для копировального воспроизведения;
  • праймеры – лабораторно синтезированные маленькие, от 15 до 30 нуклеотидов, последовательности, которые комплементарны определенным зонам изучаемой ДНК (нужны два типа – прямой/обратный, ограничивающие копируемую зону);
  • набор из четырех нуклеотидов – «строительный материал» для постройки второй ДНК-цепи;
  • ДНК-полимераза – фермент, выделенный из некоторых природных организмов (бактерий, архей), который последовательно добавляет нуклеотиды, обеспечивая достраивание новой цепи ДНК от определенного праймерного «хвоста»;
  • буферный раствор – создает нужные для протекания реакции синтеза условия и стабильную кислотность среды, предотвращает налипание реагирующих веществ на стенки сосуда и подавляет нежелательные реакции.

Все компоненты реакционной смеси в воде дистиллированной смешиваются и помещаются в амплификатор (особый прибор).

После нажатия кнопки «пуск» в приборе смесь подвергается периодическому нагреву и охлаждению.

При этом каждый этап длится строго определенное время, также строго поддерживается температура.

За один цикл образуется 2 новых ДНК-фрагмента (две цепочки ДНК представляют собой соответственно 2 матрицы).

амплификатор для ПЦР диагностики

Примерно через 25 – 35 повторений создается огромное количество молекул-копий, достаточное для дальнейшего анализа.

Отдельный цикл включает следующие этапы:

  1. Денатурация (цепочек расхождение) – при температуре порядка 95 (90 – 96) градусов в течение одной или двух минут происходит разрыв водородных связей, в результате чего цепочки ДНК расходятся.
  2. Отжиг праймеров – фиксирование к ДНК-матрице (высвободившимся из спирали молекулам ДНК) праймеров с разных концов копируемого участка. Реакция осуществляется при определенных в пределах 50 – 70 градусов температуре и времени (конкретные цифры зависят от нуклеотидного состава праймера, например, 1 минута при 60 градусах), чтобы вещества встпали во взаимодействие исключительно с заданными зонами матрицы. Разработку и синтез самих праймеров реализуют предварительно в соответствии с компьютерными расчетами.
  3. Синтез ДНК (элонгация, удлинение ДНК) – представляет собой собственно сборку полимеразой новой ДНК-цепи из «кирпичиков»-нуклеотидов, проводится обычно при 72 градусах, время зависти от длины синтезируемого фрагмента (например, 1 минута). Фермент сперва «цепляется» к матрица/праймерному комплексу, после чего «пристраивает» из раствора в соответствии с правилом комплементарности нужный нуклеотид. Производительность реакции достигает порядка 3000 нуклеотидов/минуту. Синтезированная новая молекула далее выступает в качестве дополнительной матрицы и проходит на ряду с исходной весь цикл с самого начала. В итоге концентрация реакционного продукта нарастает экспоненциально.

После окончания ПЦР образуется значительное количество ДНК, столько, что ее можно увидеть глазом невооруженным.

Образец помещается на специальный гель с окрашиванием и подвергается электрофорезу.

Под действием силы тока молекулы начинают двигаться, и чем выше молекулярная масса, тем меньше скорость движения.

По окончании электрофореза композиция окрашивается или облучается УФ-светом, и картина сравнивается со стандартной калибровочной смесью.

Оценивается совпадение расстояния, на которое переместились молекулы, с эталонными вариантами.

Детекция продуктов ПЦР возможна и посредством введения специальных меток, обуславливающих флуоресценцию фрагментов ДНК.

Таким образом выясняется есть ли нужная нуклеотидная последовательность в ДНК изучаемого образца.

Подобный подход носит название качественного.

В качестве примера рассмотрим, что такое анализ крови ПЦР на ВИЧ-инфекцию и каким образом это исследование проводится.

Допустим, что человек заразился ВИЧ.

На ранних этапах характерных признаков заболевания нет (могут отмечаться некие общеинфекционные проявления).

Но в крови инфицированного присутствуют вирусные РНК, которые в принципе возможно выявить уже на 10-е сутки после заражения.

Для изучения берут кровь, методом ПЦР пробуют отыскать ДНК вируса иммунодефицита.

исследование крови методом ПЦР

Так как это РНК-содержащий вирус, то предварительно обратной транскрипцией синтезируют ДНК.

Вносят праймеры, которые комплементарны данной ДНК, осуществляют копирование в течение пары часов, оценивают наличие искомой ДНК.

При обнаружении большого количества таких молекул, говорят о положительном результате.

Метод, при котором в качестве исходной матрицы выступает РНК называется ПЦР с обратной транскрипцией (RT PCR).

 

Какие варианты проведения имеет метод ПЦР?

Наиболее популярными вариантами в лабораториях диагностических являются:

  • с обратной транскрипцией ПЦР;
  • с «горячим» стартом ПЦР – в реакционную среду вводятся блокирующие активность полимеразы антитела, что обеспечивает запуск реакции в строго определенный момент;
  • с анализом результатов по «конечной точке» ПЦР ‑ итог оценивается по наличию флуоресценции в неоткрытом сосуде, что устраняет риск загрязнения реакционной среды (применяются ДНК-зонды с флуорофорной меткой);
  • в режиме «реального времени» ПЦР (ПЦР-РВ, Real-Time PCR) –метод количественный, в котором участвуют красители флуоресцентные, способные встраиваться внутрь спирали ДНК, увеличивая интенсивность свечения, и после каждого цикла копирования по интенсивности флуоресценции определяют количество воспроизведенных молекул;
  • мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР – в одном сосуде амплифицируется две и больше ДНК-последовательности, что позволяет определять несколько патогенов одновременно.

Для различных исследовательских целей применяются следующие варианты метода ПЦР:

  • гнездовая («вложенная») – с двумя праймерными парами, где вторая пара воспроизводит участок ДНК молекулы, полученной в первой реакции, тем самым уменьшая число нежелательных реакций;
  •  «инвертированная» ‑ реализуется, когда известен только маленький фрагмент внутри искомой последовательности (ДНК разрезается ферментами рестриктазами, а затем закольцовывается так, чтобы известные кусочки оказались на конечных участках исследуемого фрагмента);
  • асимметричная – применяется, если надо воспроизвести исключительно одну цепочку молекулы, поэтому один праймер берется в значительном избытке;
  • молекулярных колоний метод – используется акриламидный гель, который полимеризуется с реагентами ПЦР на поверхности и в итоге реакции формируются молекулярные колонии в определенных зонах полимера;
  • длинных фрагментов – проводится амплификация участков из 10 тысяч и более нуклеотидов;
  • ступенчатая – начальные циклы проводятся в высокотемпературных условиях для повышения специфичности сцепления праймеров, а после накопления молекул температура снижается;
  • случайных полиморфных фрагментов (RAPD) – дает возможность дифференцировать микроорганизмы с похожими по структуре ДНК;
  • иммуно-ПЦР – исследуются антигены, а не нуклеиновые кислоты, путем предварительного присоединения антител с ДНК-меткой и последующим воспроизведением;
  • групп-специфическая;
  • с быстрой амплификацией концов кДНК;
  • виртуальная и др.

Выяснив, для чего проводится ПЦР анализ, что это такое (цена заметно различается для разных методов), пациент понимает, чего ему ожидать от исследования.

 

Какие особенности имеются у диагностики методом ПЦР?

Прежде всего, выбор методики исследования определяется вероятным диагнозом и целями изучения.

Чаще всего используется качественный вариант ПЦР диагностики, расшифровка которого не составляет труда.

Если обнаруживается ДНК возбудителя инфекции, то результат положительный, если не обнаруживается – отрицательный.

Количественное исследование обычно реализуется с целью контроля проводимого лечения и определения вирусной нагрузки.

Наиболее часто, проводится такое исследование для ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С.

Если ДНК вируса не обнаруживается или ее содержание не достигает нижнего предела чувствительности (15-20 МЕ/мл), то в результатах фигурирует формулировка «не обнаружено». 

В остальных ситуациях на бланке можно увидеть такие варианты:

  • до 102МЕ/мл;
  • от 102 до 108 МЕ/мл;
  • свыше 108 МЕ/мл (результат превышает верхний предел измерения).

Для вирусного гепатита В регламентировано проведение противовирусной терапии, если уровень ДНК вируса превышает 10000 копий в 1 мл (2000МЕ/мл).

Снижение уровня ниже этого показателя в сочетании с сероконверсией по е-антигену (появлением защитных антител) расценивается как достижение эффекта лечения.

Для ПЦР анализа может использоваться практически любой биообразец.

Для исследования на половые инфекции берут соскобы из канала шейки матки, влагалища, уретры.

биоматериал для ПЦР

Если симптомы заболевания отсутствуют, то проводить обследование следует примерно через две недели от момента вероятного заражения.

Подготовка к ПЦР зависит от того, какой материал будет анализироваться.

При заборе из уретры рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение пары часов.

Анализ крови не требует специальной подготовки, хотя обычно проводится натощак.

Женщинам при взятии мазка из органов мочеполового тракта рекомендуется отказаться от спринцеваний, гигиенических процедур в области половых органов.

А за сутки до исследования – от половых контактов.

Анализ проводится до наступления менструации или спустя пару дней по ее завершению.

После лечения обычно контроль реализуется спустя примерно 14 суток при условии отсутствия симптоматики.

Но поскольку ПЦР может определять ДНК нежизнеспособных бактерий, желательно осуществить контрольный анализ спустя месяц после последнего прием препарата.

Преимущества метода:

  • универсальность – могут исследоваться моча, кровь (на гепатиты, ВИЧ, герпес и пр.), сперма, слизь, мокрота (на туберкулез, микоплазму, хламидии), слюна (на Эпштейна-Барр вирус, цитомегаловирус), эпителиальные клетки (из урогенитальных органов на микоплазмы, гонококки, хламидии, уреаплазмы и т.д.), соскоб конъюнктивы (на хламидии, простой герпес, гонорею) и пр.;
  • обнаружение непосредственно самого возбудителя, в отличие от многих других методов (например, ИФА основана на обнаружении продуктов распада инфекционного агента или антител, образуемых в самом организме);
  • высокая специфичность – выявляется часть ДНК, присущей исключительно данному микроорганизму;
  • высокая чувствительность – возможно обнаружение даже единичных клеточек в образце (для большей точности необходимо от 10 до 100 клеток, что меньше, чем для иных методик);
  • оперативность – на полную диагностику требуется порядка 4-5 часов, тогда как на получение результатов бакпосева уходит от нескольких суток до недель;
  • возможность установления диагноза как при острых формах заболевания, так и хронических, бессимптомных;
  • совместимость с другими технологиями исследований;
  • возможность успешно разрешать самые разнообразные исследовательские вопросы;
  • постоянное усовершенствование и разработка новых техник исполнения.

В качестве примера можно привести следующие сравнительные характеристики:

  • для хламидиоза исследование методом микроскопии имеет чувствительность 74-90%, специфичность – 98-99%, антиген-ИФА – советующие показатели составляют 71-97%/97-99%, ПЦР – 90%/99-100%;
  • для урогенитального кандидоза микроскопия – 35-45%/99%, культуральный посев – 67%/66%, РИФ-антиген – 61-81%/97%, ПЦР – 90%/98%.

Недостатки:

  • относительно высокая стоимость (варьируется от 400 до 2000 рублей примерно);
  • обнаружение микроорганизма не всегда гарантирует то, что именно этот организм – возбудитель диагностируемого заболевания;
  • не дифференцирует живые и неживые формы возбудителя;
  • возможны ложноотрицательные и ложноположительные результаты;
  • требует жесткого соблюдения правил на всех этапах исследования, начиная от момента забора;
  • требует высокой квалификации персонала.

Например, чрезмерно высокая чувствительность ПЦР при инфицировании вирусом папилломы человека определяет даже минимальное количество этого вируса.

Для выявления же клинически значимых концентраций в качестве альтернативного метода эффективнее использовать менее чувствительный метод гибридного захвата (Digene-тест).

забор мазка для Дайджин теста

Достоверность результата определяется включением в набор диагностических тестов специального параметра КВМ (аббревиатура от «контроль взятия материала»).

Тест проводится до начала ПЦР-исследования и оценивает в достаточном ли количестве присутствуют в образце анализируемые молекулы.

Референсные показатели для КВМ указываются в единицах абсолютных, минимальный пороговый уровень которых составляет 4 ед.

В ситуации, когда КВМ ниже 4, необходим повторный забор материала.

На получение ложноотрицательных/положительных результатов при исследовании влияют разные факторы.

Это технические проблемы, обусловленные качеством аппаратуры, праймеров, технологии вычислений.

Проблемы на долабораторной стадии:

  • чаще всего ложноотрицательные результаты обусловлены неправильным взятием материала, особенно в случае хламидийной инфекции, для которой типично очаговое поражение (необходимо вводить зонд диагностический в  канал маточной шейки, не ограничиваясь соскобом из уретральной ладьевидной ямки /влагалищного участка маточной шейки), также неправильные результаты случаются при ПЦР-анализе мочи у женщин;
  • ложноположительные результаты обуславливаются загрязнением пробы извне в ходе транспортировки или прямо в лаборатории.

Иногда при нескольких исследованиях отмечается чередование отрицательных/положительных результатов.

Это может объясняться не низким качеством анализов, а таким фактором, как временное носительство, характерное для некоторых условно-патогенных микроорганизмов в урогенитальном тракте.

Уреа/микоплазмы, гарднерелла и др.

В связи с выше сказанным, разработаны подробные рекомендации по диагностике каждой инфекции.

Так, хламидийную инфекцию диагностируют как минимум двумя методами (ПЦР и культуральное исследование, например).

Таким образом, высокотехнологичный метод ПЦР – уникальный инструмент в умелых руках.

Своевременное обнаружение заболеваний на ранних стадиях позволяет добиться большей результативности лечения или лучшего контроля заболевания.

Для назначения и сдачи ПЦР анализов обращайтесь к автору этой статьи – венерологу в Москве с многолетним опытом работы.