Венерология

ПЦР количественный анализ

Полимеразная цепная реакция – современный метод идентификации возбудителей инфекционных заболеваний, в том числе, венерических патологий.

Методика по точности и специфичности оставила далеко за бортом микроскопию мазков и даже бактериологические посевы.

С ее помощью можно находить фрагменты ДНК или РНК самых разных инфекционных агентов: бактерий, вирусов, грибов, простейших.

При этом не путая между собой не только представителей разных классов, но даже и видов.

анализ ПЦР количественный

Данный способ амплификации нуклеиновых кислот позволил приблизить сроки установления диагноза любого венерического заболевания к моменту обращения человека к врачу.

Чувствительность ПЦР такова, что позволяет обнаружить даже остатки генетического материала искомого микроорганизма.

Диагностика может применяться сразу после заражения половой инфекцией.

 

Как выполняется ПЦР анализ

Для выполнения анализа требуется забрать образец биологического материала.

Это выполняется врачом на приеме (возможно в день обращения).

В качестве исследуемого материала годятся кровь, отделяемое кожных высыпаний, соскобы эндотелия уретры, мазки цервикального канала, влагалища, прямой кишки, соскоб или мазок с конъюнктивы, спинномозговая жидкость, моча, сперма, простатический секрет.

Считается, что для выполнения исследования максимально точно, не достаточно воспользоваться только венозной кровью. Желательно, чтобы образец для анализа был забран из участка, где инфекционный агент вызвал воспалительные изменения.

Чтобы гарантировать чистоту образца и избежать его загрязнения посторонними микробными примесями, забор материала нужно проводить в клинике.

В исследовании пользуются амплификатором – прибором, который периодически способен в заданном режиме периодично нагревать и охлаждать пробирки с образцами биоматериала.

лабораторный амплификатор для ПЦР

Для того чтобы реакции текли быстрее, добавляют ферменты.

  • Первый этап предполагает расщепление двойной цепочки ДНК инфекционного агента.
  • Далее на короткий участок ДНК садятся две затравки (праймера) уникальные для данного вида возбудителя с образованием гибрида. Для этого требуется повышение температуры.
  • Затем участки ДНК возбудителя удваиваются и выделяются с помощью электрофореза.
  • После этого участки выявляют, изучают и идентифицируют.

Это незаменимая методика для тех возбудителей, которые умеют ускользать от серодиагностики крови или не растут на питательных средах.

 

ПЦР: качество или количество?

Количественный вариант полимеразной цепной реакции – разновидность амплификации нуклеиновых кислот.

Это способ, которым не только фиксируют присутствие нуклеотидов возбудителя, но и могут провести численный подсчет фрагментов неуклеиновых кислот.

Для проведения анализа задействуют “зонды”.

Так называют маркеры ДНК (олигонуклеотиды), позволяющие подсчитать полученный в результате анализа продукт.

Копии ДНК считаются по завершении каждого цикла амплификации.

Зонд может заменяться на флуорисцирующий краситель, который более ярко светится на помеченных участках удваивающихся ДНК.

Чем больше циклов удвоения ДНК, тем сильнее свечение.

Это позволяет судить о начальном количестве генного материала.

Просто по замеру сигнала сделать это сложно.

Поэтому пользуются методами нормировки.

Для этого сравнивают подсчитанное количество молекул в образце, имеющем заведомо известное количество молекул, и изучаемом образце.

Окончательный результат рассчитывают по формуле.

Метод также называется ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени

Его нередко сочетают с ПЦР обратной транскрипции, считая небольшие количества мРНК.

Актуален метод количественной ПЦР далеко не всегда.

Для большого числа бактериальных инфекций (уреаплазмоза, микоплазмоза) концентрация возбудителя не так важна, как сам факт его обнаружения и типирования.

Так, например, для Уреаплазмы уреалитикум сам факт выявления уже является достаточным для начала терапии.

В то время как Уреаплазма парвум в отсутствии клиники уретрита лечения не требует.

К тому же на фоне самых разных внешних факторов, включая начало специфической терапии, концентрация инфекционных агентов может меняться чуть ли не ежедневно.

Поэтому при диагностике урогенитальных инфекций ПЦР количественное определение плотности возбудителя не играет решающей роли при выборе тактики ведения пациента.

Поэтому же мазок ПЦР количественный на хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, гарднереллу, кандиду обычно не выполняется, хотя и доступен.

Вполне достаточно бывает только качественной методикой засечь генетический материал возбудителя.

Хламидийная инфекция не требует количественной оценки, так как, если обнаруживается генетический материал возбудителя, стоит начинать терапию антимикробными препаратами.

Острая фаза инфекционного процесса может быть обнаружена при исследовании крови.

Подострое или хроническое течение – при обнаружении ДНК в соскобах эндотелия половых или мочевыводящих путей.

 

Когда ПЦР количественный важен

Более востребована методика в ситуациях, когда плотность генетических носителей важна для решения об эффективности терапии или для выстраивания прогноза течения заболевания.

  • В частном случае определение количественное (ПЦР-анализ ВПЧ 21 тип) помогает сориентироваться, достаточно ли только местного лечения (например, лазерного удаления бородавки) или стоит подключать иммуностимуляторы.
  • Концентрации онкогенных папилломавирусов позволяют оценить риски развития карцином шейки матки или полового члена.
  • Степень инфекции важно оценить при герпесе. Частота рецидивов зависит от числа инфицированных нервных узлов.
  • ПЦР количественный на гепатит С и В также широко используется. Проводится не только выявление вирусов.  Особо важный момент - оценка эффективности лечения с помощью ПЦР-анализ крови к ВИЧ и гепатитам.
  • Также методикой пользуются для обнаружения элементов опухолей из плотных тканей и циркулирующих метастатических клеток (например, при раке молочной железы).

 

ПЦР количественный на ВИЧ

Во время гемотеста ПЦР ДНК ВИЧ ищется собственно вирус, поэтому нет необходимости ждать, пока в крови накопятся иммунные антитела.

ПЦР на РНК ВИЧ

Назначать исследование можно, спустя 10-14 дней от вероятного заражения.

Также такой анализ незаменим для детей от инфицированных матерей.

Количественное определение РНК ВИЧ и необходимость для лечения установления концентрации вируса – очень важный момент.

Для ВИЧ-инфицированных количество вируса важно для начала противовирусной терапии и оценки ее эффективности.

Если количество резко уменьшается, то лечение можно считать успешным.

Также количественный анализ позволяет составлять прогноз для пациента и вести мониторинг течения болезни.

Высокие титры РНК вирус при отсутствии антител (ИФА) позволяют диагностировать острую ВИЧ-инфекцию.

Но требуется повторное диагностирование методикой ИФА через 1 и 3 месяца.

У беременных с ВИЧ количественный тест на РНК проводится за три-четыре недели до родов с целью выбрать способ родоразрешения (кесарево сечение или естественные роды).

Сроки выполнения такого исследования – 2-3 дня.

Он не годится в качестве скренига на ВИЧ. Назначается только по показаниям врачом.

 

Как читается количественный ПЦР анализ на ВИЧ

Количественный РНК-тест на ВИЧ возможен для ВИЧ-1.

Анализ показывает высокую чувствительность: 20 копий в миллилитре и сто процентную специфичность.

  • От 20 до 10 миллионов копий в миллилитре укладываются в достоверный результат.
  • Если РНК не выявлена или ее количество ниже порога чувствительности теста, то ставят отметку “не обнаружено”.
  • > 10 000000 повторений – HIV1 рибонуклеиновая кислота имеется в запредельной концентрации.

 

Как готовиться к количественным исследованиям ПЦР

Специальная подготовка пациента к исследованию мазков и крови довольно проста.

отмена антибиотиков

Достаточно выполнить несколько элементарных рекомендаций.

  • Не принимать антибиотики две недели. Также нежелательно употреблять противовирусные и противопротозойные лекарственные средства.
  • Нельзя применять местные антисептики, в том числе, в средствах для интимной гигиены.
  • Перед забором материала из уретры не следует мочиться на протяжении двух часов.
  • Если планируется исследовать сперму, две суток не показан секс.
  • Забор венозной крови проводится натощак.

Как собирают образцы:

  • У мужчин образцы мазков и соскобов эндотелия из уретры выполняет венерологи ил уролог. Используется урологический зонд, который водится на глубину 3-4 сантиметра и извлекается с легким нажатием на стенку мочеиспускательного канала. Материал помещается в специальную пробирку и доставляется в лабораторию.
  • У женщин пробы забираются во время осмотра на кресле. Сначала из мочеиспускательного канала (петлей из пластика, тампоном, погружаемым на глубину 2 сантиметра и извлекаемым с легким нажимом). Затем влагалищное отделяемое собирают стерильным ватным тампоном, ориентируясь на воспалительно измененные участки или задний влагалищный свод. Для цервикального канала предусмотрен тампон-щеточка или ватный тампон.

взятие ПЦР мазков на кресле

  • Сперма и моча собираются в лаборатории пациентом в стерильную лабораторную посуду.
  • Мазки из ротоглотки, отделяемое конъюнктивы, мазки из прямой кишки выполняет средний медперсонал во время приема.
  • Простатический секрет после массажа простаты на приеме у уролога.

ПЦР количественный готовится для мазков в течение одних суток, для образцов крови – 2-3 дня.

 

Интерпретация количественного ПЦР мазков и крови

Чаще всего пользуются количественной вариацией полимеразной цепной реакции для диагностики вирусных инфекций по анализу крови.

Применить методику в случаях гепатита С возможно и рационально, если положителен ранее проводившийся качественный анализ на РНК в сыворотке крови.

Также метод годится, когда надо определить вирусную нагрузку, выбрать тактику ведения пациента, точно оценить результаты терапии.

  • Если РНК не нашли или концентрация ее ниже порога чувствительности теста, то делают отметку “не обнаружено”.
  • <10^2 ME на мл означает положительный ответ при концентрации возбудителя менее 10^2;
  • От 10^2 до 10^8 МЕ на мл – положительно, значение в пределах линейного диапазона.
  • >10^8 ME на мл – ответ положительный, концентрация вируса более 10^8.

ДНК папилломавирусов также определяют количественно.

Анализ служит для верификации 14 разновидностей вирусов с разной онкогенностью.

В качестве материала используются соскобы эндотелия урогенитального тракта.

Цель не только определить, какие из вирусов имеются у данного пациента (68, 66, 59, 58, 56, 52, 51, 45, 39, 35, 33, 31, 18 или 16 типов).

Анализ позволяет решить, нужна ли терапия данному человеку, и оценить его риски по развитию урогенитальных онкозаболеваний.

Так высокий онкогенный риск показывают вирусы 68, 59, 39, 33, 31, 18 и 16 типов.

типирование на онкогенные штаммы ВПЧ

У прочих вирусов риск онкогенности низкий или средний.

Высокие титры ДНК служат маркером прогрессирования инфекции и высоких рисков.

Резкое снижение тиров на фоне терапии говорит о благоприятном прогнозе.

Пометка на бланке анализа ПЦР «ДНК обнаружено» подтверждает наличие данного серотипа вируса папилломы человека в образце мазка или соскоба.

Данное исследование очень важно для женщин.

Так как для них папилломавирус – основная причина развития рака шейки матки, который одновременно является самой частой причиной инвалидности и смертности у молодых женщин.

Детекция в реальном времени дезоксирибонуклеиновой кислоты вирусов герпеса 1 и 2 типа возможна в соскобах эндотелия урогенитального тракта.

Показана она не только при наличии клиники герпетических поражений в области гениталий.

Но и как скрининг перед планированием беременности и для дифференциальной диагностики венерических заболеваний.

 

Дополнительные бонусы количественной методики ПЦР

Как и другие исследования, количественная амплификация нуклеотидов очень хороша, если назначать ее в подходящей ситуации и по показаниям.

  • Не требуется значительного промежутка времени от заражения до накопления исследуемого материала, как например, при серологической диагностике крови (например, антител при ИФА). Качественный метод, как и количественная ПЦР могут реагировать на присутствие даже очень небольших фрагментов ДНК или РНК возбудителей. Просто в разные периоды болезни количество выявленных фрагментов генома инфекционного агента будет различным.
  • Укорочение сроков диагностического поиска (от суток для мазков и до двух-трех дней для крови) позволяет при необходимости незамедлительно начать специфическое лечение любого вида венерического заболевания.
  • Погрешности методики в основном связаны с загрязнением образцов посторонними микробными агентами. Этого можно избежать, если забор материала для исследования проводится в условиях клиники опытным специалистом.
  • Выбирая современную клинику, пациент сможет оградить себя от погрешностей диагностики, связанной с недостаточным качеством оборудования или расходных материалов.

 

ПЦР количественный: куда обратиться

Если возникает потребность в количественном анализе ПЦР на любую инфекцию, требуется лечение половой инфекции или его контроль, смело можно обращаться к специалистам нашей клиники.

венеролог Ленкин Сергей Геннадьевич

Существует целый ряд ситуаций, когда только количественной вариацией полимеразной цепной реакции можно удовлетворить требованиям диагностического поиска.

Большинство вирусных инфекций, передаваемых половым путем для уточнения стадии, начала лечения, оценке его пользы требуют именно этого исследования.

И качественный, и количественный ПЦР-тест крови, мазков или соскобов можно выполнить в нашей клинике.

Весь процесс от забора материала до оценки результата и назначения лечения можно пройти в одной клинике.

Репутация, которую мы завоевали на рынке медицинских услуг, – это результат слаженного труда коллектива профессионалов.

Пациенты чувствуют это даже на этапе первого обращения или записи на консультацию.

У нас все этапы диагностики выполняются безболезненно и качественно в самые короткие сроки.

Обратившись в нашу клинику, вы гарантированно получаете точные результаты диагностики и самые современные методики лечения.

Для сдачи анализа ПЦР количественный обращайтесь к автору этой статьи – венерологу в Москве с многолетним опытом работы.